核心原理概述
該試劑盒的核心原理是(shi)：利用高離(li)序鹽(yan)（如鹽(yan)酸胍，通常存在于溶液RL中）使細胞裂解，同時抑制RNase活性；然后(hou)通過調節鹽(yan)濃度(du)和乙(yi)醇濃度(du)，使RNA選擇性地(di)吸(xi)附到硅(gui)膠膜上；之后(hou)用洗(xi)滌液去除雜質；最后(hou)用無(wu)RNase水將RNA從膜上洗(xi)脫下來(lai)。
詳細步驟分析
準備工作：在溶液RPI、RW中加入無水乙醇
- 作用：溶液RPI和RW是洗滌液，其有效成分溶解在乙醇中。加入乙醇是為了使洗滌液具備適當的洗滌能力：
- RPI：通常含有高濃度離序鹽和乙醇，用于去除殘留的蛋白質、鹽類等雜質，并維持RNA結合在膜上的條件。
- RW：通常是低鹽的乙醇溶液，用于去除鹽分并帶走殘留的有機物，同時使乙醇揮發，為后續的洗脫做準備。
第1步：樣品處理與裂解
- 作用：徹底破碎細胞，釋放RNA，并立即滅活RNase。
- 關鍵試劑：溶液RL（裂解液）
- 它通常含有強變性劑（如鹽酸胍或異硫氰酸胍），能迅速破壞細胞膜和核膜，使蛋白質變性，并高效地抑制內源性和外源性的RNase，防止RNA被降解。
- 注意點：
- 組織研磨：液氮研磨能瞬間低溫固定組織，防止RNA降解。
- 不加量不足：裂解液不足會導致裂解不徹底，部分RNase可能仍有活性，且基因組DNA會因粘度高而難以完全去除，導致DNA污染。
- 不洗滌細胞：PBS等洗滌液可能引入RNase或導致細胞在懸浮過程中裂解，mRNA會在此過程中迅速降解。
第2步：室溫孵育
- 作用：確保裂解反應和核酸-蛋白復合物的解離完全進行，讓RNA充分釋放到裂解液中。
第3步：可選離心/酚氯仿抽提
- 作用：預清除雜質。
- 常規離心：對于蛋白、脂肪、多糖含量高的樣品，此步驟可以去除這些不溶性雜質，防止它們堵塞純化柱。上清中含有RNA、DNA、可溶性蛋白等。
- 酚氯仿抽提（針對多糖多酚植物樣品）：
- 高鹽（NaCl）：使多糖更易沉淀到有機相或界面。
- 酚/氯仿：酚是強變性劑，能有效沉淀蛋白質；氯仿能促進相分離并帶走脂肪。這個步驟能強力去除大部分蛋白質、多糖、脂質和DNA，得到一個相對純凈的含RNA的上清液，極大減輕后續純化柱的負擔，提高植物RNA的產量和質量。
第4步：加入氯仿
- 作用：液-液萃取，分離RNA。
- 原理：氯仿是一種有機溶劑。加入氯仿并離心后，溶液會分為三層：
- 上層（無色水相）：含有RNA（由于RNA是親水的）。
- 中間層（白色）：變性的蛋白質和DNA。
- 下層（黃色有機相）：脂類、色素、疏水性蛋白及其他細胞碎片。
- 通過此步驟，RNA被富集在水相中，與絕大部分蛋白質、DNA和脂質分離開。
第5步：離心并轉移水相
- 作用：精確收集含有RNA的水相。
- 關鍵：必須非常小心，只吸取無色的上層水相，絕對不能觸碰到中間的白色蛋白層，否則會導致嚴重的蛋白質和DNA污染。
第6步：加入乙醇并上柱
- 作用：創造RNA結合到硅膠膜上的最佳條件。
- 原理：在高離序鹽（來自裂解液殘留）存在的條件下，加入乙醇使溶液環境成為“低水相”。在這種環境下，RNA的磷酸骨架會暴露，并通過氫鍵和靜電作用力可逆地吸附在硅膠膜上。而其他雜質（如蛋白質、代謝物）則不能有效吸附，隨溶液流走。
- “可能會出現沉淀”：這通常是鹽（如SDS在乙醇中沉淀）或某些雜質在乙醇中析出，不影響RNA的結合。
第7步：用溶液RPI洗滌
- 作用：第一次洗滌，去除殘留的蛋白質、鹽分和其他雜質。
- 原理：RPI中含有離序鹽和乙醇，能維持RNA結合在膜上的狀態，同時將未能緊密結合的雜質洗脫掉。
第8-9步：用溶液RW洗滌（兩次）
- 作用：第二次和第三次洗滌，徹底去除鹽分和殘留的乙醇，為RNA洗脫創造純凈的環境。
- 原理：RW是低鹽的乙醇緩沖液。它能：
- 洗去殘留的離序鹽。鹽分如果殘留，會抑制后續的酶反應（如逆轉錄、PCR）。
- 乙醇能帶走殘留的有機物并促進液體揮發。
- 靜置2分鐘：讓洗滌液與膜充分接觸，確保鹽分被完全洗去。
第10步：高速空離
- 作用：徹底去除殘留的乙醇。
- 關鍵性：這是至關重要的一步。哪怕微量的乙醇殘留都會嚴重抑制后續的酶促反應。離心后通風晾干是為了讓痕量的乙醇徹底揮發。
第11步：洗脫
- 作用：將純凈的RNA從硅膠膜上釋放下來。
- 原理：使用無RNase的水（低鹽或無鹽環境）?破壞RNA與硅膠膜之間的氫鍵和靜電作用，使RNA重新溶解到水中，從而被洗脫下來。
- 室溫放置2分鐘：讓水與膜充分接觸，使RNA水合溶解，提高洗脫效率。
- 提高得率技巧：用少量水（如30-50μl）洗脫一次后，將得到的洗脫液重新加回到同一個純化柱中，離心第二次，可以顯著提高RNA的最終濃度。
- 保存：RNA在-70°C以下可以長期穩定保存，因為超低溫能最大限度地抑制所有RNase的活性。
總結
這個流程是一個經典的?“裂解 -> 相分離 -> 結合 -> 洗滌 -> 洗脫”?過(guo)程。每一步(bu)都環環相扣，旨在最(zui)大限度地(di)獲得高(gao)純度、高(gao)完整性且無酶抑制物污染(ran)的(de)RNA，為下游實(shi)驗(yan)（如(ru)qRT-PCR、RNA測序等）的(de)成功奠定基礎。