KASP（Kompetitive Allele-Specific PCR，競爭性(xing)等位基(ji)因特(te)異性(xing)PCR）是一(yi)種(zhong)(zhong)基(ji)于(yu)(yu)PCR的基(ji)因分型(xing)技術，主要用于(yu)(yu)檢(jian)測單核苷酸多(duo)態性(xing)（SNP）和其(qi)他特(te)定基(ji)因變異。廣泛應(ying)用于(yu)(yu)農業育(yu)種(zhong)(zhong)、醫學(xue)研究(jiu)、群體遺傳學(xue)等領域(yu)。
引物設計開發流程如下
- 獲取SNP信息，要求兩親本在SNP位置的堿基序列不同，同時該SNP上游20bp、下游40bp無其他SNP, SNP信息可通過全基因組測序得到，也可通過重測序得到；
- 提取親本DNA、F1代DNA
- 引物設計：
- 從SNP所在堿基開始往上游數20bp作為左引物f，SNP的堿基作為左引物的第20個堿基，于是有左引物f1，f2;
- 使用引物設計軟件或引物設計網站（//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）固定左引物f，通過blast得到右引物R，產物大小需小于60bp；
- 左引物f1、f2分別加上接頭A1、A2（接頭序列A1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，A2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT）序列為F1、F2，即F1=A1f1，F2=A2f2；
- 合成序列F1，F2，R，選用ULTRPAGE純化方式；
- 將引物干粉溶解，按比例配制成Primer Mix
- 引物篩選：每種引物每個親本及F1最少跑2個孔。
- 擴增結束后使用熒光定量PCR讀帶：讀帶程序如下：
25℃ for 5s + Plate Read。讀帶完成后，選定熒光類型FAM、HEX、ROX,選擇Allelic Discrimination進行分析 - 挑選其中聚類明顯的引物作為候選標記。
- 將候選標記用于群體，若聚類效果明顯則可作為KASP標記，聚類效果不明顯則不能作為標記。
一般來說，實驗初期需要選擇多個位點設計不同引物進行實際驗證，從中選出聚類效果明顯的作為最終的引物用于實驗。KASP 本身是一個非常依賴引物設計的技術，如果反復優化無果，很可能引物在 SNP 區位的設計可以進一步改善。
配置反應體系
- 模板DNA：通常每個反應加入2.5-25ng/ul高質量DNA可滿足分型需求。具體投入量根據實驗使用物種的基因組大小判斷，遵循大基因組高投入，小基因組低投入原則投入適當DNA。請盡量保持DNA濃度一致。
- 引物：按比例混合 F1、F2、R 各為 10 μM 的 Primer Mix（體積比 1:1:2.5）
- KASP PCR MixPlus : KASP PCR Mix、KASP Probe Mix 全部組分混合振蕩均勻
PCR擴增(zeng)體系(xi)如下(xia)(10ul體系(xi))
| Component | Volume |
| DNA | 25-250ng |
| KASP PCR MixPlus | 5ul |
| Primer mix | 0.76ul |
| 超純水 | 補齊至10ul |
陰性對照設置
為保證基因分(fen)型數(shu)據的(de)(de)(de)(de)準確性，除測試(shi)樣(yang)品(pin)外，還應在PCR板上使用對照(zhao)樣(yang)品(pin)。建議每個基因分(fen)型板上包含兩個NTCs (無(wu)模(mo)板對照(zhao))。NTC孔(kong)的(de)(de)(de)(de)熒光信(xin)號強度(du)與模(mo)板DNA孔(kong)的(de)(de)(de)(de)信(xin)號強度(du)差異(yi)可以提高對基因分(fen)型數(shu)據有效性的(de)(de)(de)(de)判定。通(tong)常(chang)NTC樣(yang)品(pin)的(de)(de)(de)(de)信(xin)號值(zhi)應接近原(yuan)點，NTC孔(kong)中觀察(cha)到的(de)(de)(de)(de)任何擴增都表明存(cun)在污染或非特異(yi)性擴增，能夠輔(fu)助分(fen)型數(shu)據的(de)(de)(de)(de)判讀(du)。
設定反應程序進行KASP反應
| Stage | Temperature | Time | Number of Cycles |
| Hot-start Taq activation | 95℃ | 1 min | 1 |
| Touchdown | 95℃ | 15 sec | 10 |
| 60→54℃，-0.6℃/循環 | 15 sec | ||
| 72℃ | 20 sec | ||
| Amplification | 95℃ | 15 sec | 26-35 |
| 54℃ | 15 sec | ||
| 72℃ | 20 sec | ||
| Read | 30℃ | 60 sec | 1 |
循(xun)環數建議根(gen)據物(wu)種基因組大小和投入量確定，如(ru)首次(ci)(ci)實驗無(wu)成(cheng)熟程序，建議采取26個(ge)循(xun)環進行初始反應，后(hou)續逐次(ci)(ci)增加循(xun)環進行最適條件摸(mo)索。
若初始PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)結(jie)束后未(wei)獲得明確基(ji)因(yin)型分簇，可以(yi)按照擴(kuo)(kuo)增(zeng)循環(huan)條件增(zeng)加3個循環(huan)(94°C 20 sec，57°C 60 sec)，并再次讀取和分析(xi)熒(ying)光信(xin)號值(zhi)。若分簇結(jie)果仍不夠理想，可以(yi)繼續增(zeng)加PCR循環(huan)，直至(zhi)觀(guan)察到(dao)緊密且分離良好的基(ji)因(yin)型分簇為止。
熒光讀取
選(xuan)定(ding)熒光(guang)類型FAM、HEX、ROX,選(xuan)擇Allelic Discrimination進行分析（根據實際儀(yi)器進行操作(zuo)）