通用RNA提取試劑盒
產品組分
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貨號 |
R1051（50?次） |
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溶液?RL |
60 ml |
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溶液?RPI |
18 ml |
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溶液?RW |
12 ml |
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DEPC處理水 |
10 ml |
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RNase-free?純(chun)化(hua)柱(zhu) |
50?個 |
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RNase-free?離心管 |
50?個 |
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說明書 |
1?份 |
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需要自備的溶液
●??氯仿
●??無水乙醇
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產品說明
通用RNA提取試劑盒是經過改進開發的新一代產品，提高了裂解液的裂解能力和提取的靈敏度，通過在特定適宜的條件下特異、可逆地結合RNA，而各種蛋白質和其他雜質均可被去除掉，同時改進的硅基質膜增強了對RNA的吸附能力，得到的RNA純度更好，質量更高。該試劑盒可從各種細胞或組織中快速提取總RNA，每個吸附柱每次可處理50–100 mg?組織或5×106?細胞，可同時處理大量不同樣(yang)品，一個小時內即可完成(cheng)反應。提取的總RNA沒(mei)有DNA和(he)蛋白的污染(ran)，可用于(yu)Northern blot、Dot blot、polyA?篩選、體外翻譯(yi)、RNase保護分析和(he)分子克(ke)隆(long)等(deng)。
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保存條件
溶液(ye)(ye)RL應在2-8℃避(bi)光保存(cun)，其他溶液(ye)(ye)和(he)純化柱室溫保存(cun)。
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注意事項---------------------------------------------------------------------------------------------------------
●??初次使用溶液RPI和溶液RW前，需按比例加入(ru)無(wu)水乙(yi)醇。18 ml溶液RPI中加入(ru)12 ml無(wu)水乙(yi)醇（3:2），12 ml溶液RW中加入(ru)48 ml無(wu)水乙(yi)醇（1:4）。
●??嚴防操作環境、使用的容器、耗(hao)材和試劑的RNase污染。操作過程中勤換手套。
●??使用本產品(pin)提取的RNA一般不含有DNA污染。在極少數情(qing)況下（與(yu)組織pH值等相關），如果有DNA污染而又必須(xu)去除，則(ze)可以(yi)用RNase-free的DNase處理樣品(pin)。
●??請嚴格遵照操作(zuo)步驟(zou)操作(zuo)。
●??不同(tong)起始材(cai)料(liao)的(de)用(yong)量及溶液RL的(de)用(yong)量不同(tong)（參見下表(biao)），過多或(huo)過少(shao)的(de)使用(yong)量都可(ke)能影(ying)響RNA的(de)質量或(huo)產(chan)量。若起始材(cai)料(liao)量很少(shao)，RNA預(yu)計產(chan)量很低，在異丙醇沉淀時(shi)，可(ke)加入20mg/ml的(de)肝(gan)糖原溶液0.5-1 μl促進RNA沉淀。
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樣品用量 |
溶液RL的用量 |
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10cm2的貼壁培養細胞 |
1 ml |
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107的懸浮培養細胞 |
1-2 ml |
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100 μl的(de)白細(xi)胞 |
2 ml |
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50-100 mg的普(pu)通組織(zhi)樣(yang)品 |
1 ml |
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50-100 mg的特殊組織樣(yang)品（肝(gan)、脾(pi)、骨(gu)及軟骨(gu)等） |
2 ml |
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15-30 mg的植物(wu)材(cai)料（多糖和(he)多酚含(han)量不高(gao)的） |
1 ml |
●??有關RNA的吸光度(du)說明如下：
260nm、320nm、230nm、280nm下的(de)吸光度(du)分(fen)別(bie)代(dai)表核酸(suan)、背景（溶液(ye)渾(hun)濁度(du)）、鹽濃(nong)度(du)和(he)蛋(dan)白質(zhi)等有機物(wu)的(de)污染(ran)程度(du)，質(zhi)量較好的(de)RNA的(de)R值應在1.8-2.0之間(jian)，當(dang)R<1.8時(shi)，溶液(ye)中的(de)蛋(dan)白質(zhi)等有機物(wu)的(de)污染(ran)比(bi)較明(ming)顯；當(dang)>2.2時(shi)，說(shuo)明(ming)RNA已經被水解成(cheng)單核苷酸(suan)。
●??RNA濃度=（OD260-OD320）*稀釋倍數*0.04 μg/μl。
操作步驟---------------------------------------------------------------------------------------------------------
第一次使(shi)用前應在溶液(ye)?RPI、溶液(ye)?RW中加(jia)入(ru)無水乙(yi)醇，加(jia)入(ru)量請參(can)見瓶上標簽。
1. ?樣品處理
●?組(zu)織(zhi)：將組(zu)織(zhi)在液(ye)(ye)氮中(zhong)磨碎。每50–100 mg組(zu)織(zhi)加(jia)1 ml溶(rong)液(ye)(ye)RL，用勻(yun)漿儀進(jin)行勻(yun)漿處理。樣品體(ti)(ti)積(ji)不(bu)應超過(guo)溶(rong)液(ye)(ye)RL體(ti)(ti)積(ji)的十(shi)分之一(yi)。
●?單層培養細胞：直接在培養板中加入溶液RL裂解細胞，每10 cm2?面積加1 ml溶液RL。用(yong)取樣器抽打幾次。
●??溶液RL的(de)加入(ru)量(liang)根(gen)據培養瓶面積決定，不(bu)是由細胞數決定。如(ru)果加量(liang)不(bu)足，可(ke)能導致提(ti)取的(de)RNA中有DNA污染(ran)。
c. ?細胞懸液：離心取細胞，棄上清。每5–10×106動物細(xi)(xi)(xi)胞(bao)和植物細(xi)(xi)(xi)胞(bao)加入1 ml溶液RL。加溶液RL前不要(yao)洗滌細(xi)(xi)(xi)胞(bao)，以免降解mRNA。
2. ?將(jiang)勻漿樣品在15–30℃放置5 min，使得核酸(suan)蛋白復合物(wu)完全(quan)分離。
3. ?可選(xuan)步驟：4℃ 12,000 rpm (~13,400×g)?離心5分鐘，取上(shang)清，轉入一個新(xin)的無RNase的離心管中。
●??如果(guo)樣品中(zhong)含有較多蛋白(bai)、脂(zhi)肪、多糖或肌肉(rou)、植物(wu)結節部分等，可加此步驟離(li)心(xin)去除(chu)。離(li)心(xin)得到的沉淀中(zhong)包(bao)括細胞外膜(mo)、多糖、高分子(zi)量DNA，RNA存在(zai)于上(shang)清溶液(ye)中(zhong)。
（如樣品含有(you)較多(duo)(duo)多(duo)(duo)糖多(duo)(duo)酚，請(qing)增加(jia)以下(xia)步(bu)驟(zou)，在上(shang)(shang)清(qing)液(ye)(ye)(ye)中加(jia)入(ru)0.2×上(shang)(shang)清(qing)液(ye)(ye)(ye)體積的(de)5 M NaCl及1×上(shang)(shang)清(qing)液(ye)(ye)(ye)體積的(de)酚/氯(lv)仿（1:1），混勻，12000 rpm?離(li)心5-10 min?，取(qu)上(shang)(shang)清(qing)液(ye)(ye)(ye)加(jia)入(ru)等體積氯(lv)仿，混勻，12000 rpm?離(li)心5-10 min，至第4步(bu)。）
4. ?加入200 μl氯仿，蓋(gai)好管(guan)蓋(gai)，劇(ju)烈振蕩15 s，室溫(wen)放(fang)置3 min。
5. ?4℃ 12,000 rpm離心10 min，樣品會分(fen)成三(san)層(ceng)，從上至下(xia)依(yi)次是：無色(se)(se)的(de)水相(xiang)，白(bai)色(se)(se)的(de)中間(jian)層(ceng)和黃(huang)色(se)(se)的(de)有機相(xiang)，RNA主要存在(zai)于水相(xiang)中，水相(xiang)的(de)體積約(yue)為所用溶液RL試劑的(de)60%。把水相(xiang)轉(zhuan)移到新管中，進行(xing)下(xia)一步操作。注意(yi)不(bu)要吸到中間(jian)層(ceng)。
●??第一次使用前應在溶液?RPI、溶液RW中(zhong)加(jia)入無水(shui)乙醇，加(jia)入量請參見(jian)瓶上標簽。
6. ?緩慢加入0.5?倍體積無水乙醇，混勻（此時可能會出現沉淀）。將得到溶液和沉淀一起轉入純化柱中，4℃ 12,000 rpm離心30 s。4℃ 12,000 rpm離心30 s，棄掉收集管中的廢液。
●??若(ruo)溶液體積(ji)大于純(chun)化柱容積(ji)（700 μl），可(ke)分兩次離心。
7. ?向純化柱中加入500 μl溶液RPI（使用前請先檢查是否已加入乙醇），4℃ 12,000 rpm離(li)心30 s，棄(qi)廢液。????
8. ?向純化柱中加入500 μl溶液RW（使用前請先檢查是否已加入乙醇），室溫靜置2 min，?4℃ 12,000 rpm離心30 s，棄(qi)廢液。
9. ?向純(chun)化柱中加(jia)入(ru)500 μl溶液RW，室(shi)溫靜(jing)置2分鐘，4℃ 12,000 rpm離(li)心30 s，去除(chu)殘余液體。
10. ?將純化柱放入2ml收(shou)集管(guan)中，4℃ 12,000 rpm離(li)心2 min，去除(chu)殘余液(ye)體。
●??此步驟的(de)目的(de)是將(jiang)純化柱(zhu)中殘(can)余的(de)漂洗液去(qu)除(chu)，離心后將(jiang)純化柱(zhu)在室溫放置片刻(ke)，或置于超(chao)凈(jing)工作(zuo)臺上(shang)通(tong)風片刻(ke)，以充分晾干。如果有漂洗液殘(can)留，可能會影(ying)響后續的(de)RT等實(shi)驗操(cao)作(zuo)。
11. ?將純化柱轉入一個新的離心管中，加30–100 μl RNase-free ddH2O，室溫放置2 min，4℃ 12,000 rpm離心2 min。
●??洗脫緩沖液體積不應少于30 μl，體積過小影響回收效率。且RNA應保(bao)存在-70℃（-80℃），以防降解(jie)。
●??如果(guo)想提(ti)高RNA得率，可重復上步操(cao)作一次，合并兩次得到的溶(rong)液。
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