要(yao)先對PCR目的序列的長度有個大(da)致(zhi)估(gu)計：

第(di)一(yi)步：找到(dao)Primer3的(de)站點。你不用記(ji)住這(zhe)個站點，但(dan)是(shi)要(yao)記(ji)住“Primer3”這(zhe)個詞，然(ran)后打開GOOGLE首頁，輸入Primer3，跳出來(lai)的(de)第(di)一(yi)個項目就是(shi)了“”

網址是。

第二步：貼上模板序列。進(jin)入Primer3站(zhan)點，可(ke)以(yi)看到一個(ge)引物設計(ji)的(de)(de)界面。在“Paste?source sequence?below (5'->3'…..”下面的(de)(de)大空框里面把你的(de)(de)模板序列粘(zhan)帖進(jin)去。注意是5'->3'方向的(de)(de)，數字或者空格都沒關系，軟件會(hui)自動過(guo)濾(lv)的(de)(de)。

第三步：重要參數設定。首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望軟件給你隨便做的話，首先要調整的就是這個參數。默認的參數實際上是從100到1000，這個你得自己改，如果你希望產物的大小符合你的預期，盡可能把范圍改小，比如480-500，具體看情況調整。第二個參數是“Primer Size”，默認值一般可以用，但是，當你用熟了這個軟件，你自己就知道該怎么改了。第三個參數是”Primer Tm”這個(ge)和Primer Size差不多。

第四步：Pick primers：?點(dian)一下這個按鈕，符合你大小(xiao)預期的(de)primer就出(chu)來了(le)，看(kan)(kan)看(kan)(kan)Primer3 Output的(de)界(jie)面(mian)，多么(me)漂(piao)亮！你要(yao)(yao)的(de)primer出(chu)來了(le)，而且有primer在序列上的(de)位(wei)置(zhi)比對圖，還(huan)(huan)要(yao)(yao)primer本身(shen)的(de)信息，包(bao)括(kuo)位(wei)置(zhi)，長度，Tm，GC含量，任何位(wei)置(zhi)互補堿(jian)基數，3'端(duan)互補堿(jian)基數，以及引物序列，（注意，下游引物是5'->3'），還(huan)(huan)要(yao)(yao)產物大小(xiao)，兩引物間任意互補堿(jian)基數，兩引物間3'端(duan)互補堿(jian)基數等。如果引物尚在參數設定的(de)范圍內，但還(huan)(huan)不是最佳，將會(hui)給出(chu)警告。

第五(wu)步：引(yin)(yin)物(wu)設(she)(she)計(ji)檢驗(yan)：可(ke)(ke)(ke)以(yi)僅僅設(she)(she)計(ji)一(yi)向引(yin)(yin)物(wu)，只要在Pick?left?primer或(huo)者Pick?right?primer前面的(de)(de)(de)(de)勾勾掉一(yi)個就可(ke)(ke)(ke)以(yi)。也可(ke)(ke)(ke)以(yi)自己定義(yi)引(yin)(yin)物(wu)，放在Primer框里(li)，（注意(yi)，下游(you)引(yin)(yin)物(wu)的(de)(de)(de)(de)書寫反向仍(reng)然(ran)是5'->3'）如果符合設(she)(she)定的(de)(de)(de)(de)條(tiao)件(jian)，軟件(jian)將對(dui)給出引(yin)(yin)物(wu)評分(fen)，同時給出警(jing)告(gao)(gao)信(xin)(xin)(xin)息，根據警(jing)告(gao)(gao)信(xin)(xin)(xin)息可(ke)(ke)(ke)以(yi)適當對(dui)自定義(yi)引(yin)(yin)物(wu)做(zuo)些調(diao)整即可(ke)(ke)(ke)，警(jing)告(gao)(gao)信(xin)(xin)(xin)息也讓(rang)你做(zuo)實驗(yan)的(de)(de)(de)(de)時候(hou)心中有(you)數。對(dui)于(yu)文獻(xian)發表的(de)(de)(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)，最(zui)好(hao)都要檢查一(yi)下，這(zhe)樣(yang)(yang)就可(ke)(ke)(ke)以(yi)避(bi)免被別人(ren)有(you)意(yi)無(wu)意(yi)誤(wu)導。至于(yu)RT-PCR所用(yong)的(de)(de)(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)，最(zui)好(hao)是使(shi)得產物(wu)跨過內含(han)子(zi)，這(zhe)樣(yang)(yang)避(bi)免潛在DNA對(dui)RT-PCR的(de)(de)(de)(de)干擾。實際做(zuo)引(yin)(yin)物(wu)的(de)(de)(de)(de)時候(hou)，要把內含(han)子(zi)都去掉，僅僅把外顯(xian)子(zi)序列(lie)放入源序列(lie)框中，并(bing)且(qie)通過自定義(yi)引(yin)(yin)物(wu)設(she)(she)計(ji)的(de)(de)(de)(de)方法(fa)，使(shi)上下游(you)引(yin)(yin)物(wu)分(fen)別全部(bu)或(huo)者部(bu)分(fen)落在不同外顯(xian)子(zi)上。至于(yu)如何快速識別內含(han)子(zi)和外顯(xian)子(zi)以(yi)及電子(zi)PCR，我將抽空(kong)另做(zuo)說明。

至(zhi)于設(she)計出來的(de)(de)引(yin)物(wu)的(de)(de)實際效(xiao)果，根據我的(de)(de)經驗，一般情況下都(dou)能做到PCR一次成(cheng)功，也(ye)許隨便那一段序列做引(yin)物(wu)也(ye)能達到很好的(de)(de)效(xiao)果，但是不管怎么說，軟件做引(yin)物(wu)可以(yi)讓自己心(xin)中有數。最(zui)后，GOOD LUCK TO EVERYONE.