DNA 電泳(yong)是分子生物學實驗(yan)的“基(ji)本功”，幾(ji)乎所有(you)科(ke)研人(ren)員都繞(rao)不(bu)開。雖然操作看(kan)似簡(jian)單，但(dan)原理(li)與細節(jie)不(bu)少，一旦忽(hu)視就可能導致條帶模糊、結(jie)果(guo)失真，甚至實驗(yan)“全軍覆沒”。今(jin)天我們(men)來拆解幾(ji)個常見的誤區，從理(li)論到實踐，幫你真正理(li)解電泳(yong)原理(li)，少走(zou)彎路。

???原理回顧：DNA 為什么能“跑起來”？

DNA電(dian)泳過程(cheng)示意圖(tu)

DNA 電泳依賴的是?電場驅動：帶負電(dian)荷的 DNA 分子在電(dian)場中(zhong)向正極遷(qian)移。遷(qian)移速度主要受(shou)以(yi)下(xia)因素影響：

分子大小：小分子(zi) DNA 在凝膠孔(kong)隙中阻力(li)小，遷移更快(kuai)。

瓊脂糖濃度：濃度(du)越高，凝膠(jiao)網孔(kong)越密，分辨小(xiao)分子的能力更強(qiang)。

電壓與緩沖液：電(dian)壓過高(gao)會(hui)導致(zhi)發熱(re)，緩沖液(ye)離子濃度不當會(hui)影響(xiang)電(dian)流與分辨率。

核酸構象：線性 DNA、超螺(luo)旋質粒(li)(li)、開環(huan)質粒(li)(li)遷移速度各不相(xiang)同，超螺(luo)旋質粒(li)(li) > 線性 DNA > 開環(huan)質粒(li)(li)。

超螺旋質粒（Supercoiled DNA）構象緊密，分(fen)子(zi)呈現(xian)高度(du)壓縮狀態。在凝膠孔隙中受到的阻力最小 → 遷移速度(du)最快。

線性 DNA（Linear DNA）構象伸展，遷移速度(du)主要(yao)取決于(yu)(yu)分(fen)子(zi)大(da)小。一般情(qing)況下，速度(du)介于(yu)(yu)超(chao)螺(luo)旋(xuan)和開環之間。

開環質粒（Nicked/Relaxed Circular DNA）因(yin)單鏈切口導致環形松弛(chi)，構象最(zui)“蓬松”。在凝膠中阻力最(zui)大 → 遷移速度最(zui)慢。

理解這些原理，才(cai)能真正避免實驗中“看不懂”的(de)現象。

???常見誤區一：瓊脂糖濃度隨意配

瓊脂糖是從海藻中提取的一種線性聚合物，加熱(re)溶(rong)解后再冷卻會形成具有網狀結構(gou)的凝(ning)膠。這個(ge)(ge)網絡(luo)就像一個(ge)(ge)個(ge)(ge)篩孔。

瓊脂糖濃度對遷移率和分辨率的具體影響：

a. 對遷移率（Mobility）的影響

對于同一大小的DNA片段，瓊(qiong)脂糖濃(nong)度越高，其受到的阻(zu)力(li)越大，遷(qian)移速度越慢(man)。反之，濃(nong)度越低，遷(qian)移越快。

因此(ci)，在不同濃(nong)度的凝膠(jiao)上，同一(yi)個DNA片(pian)段的遷移位置是不同的，不能直(zhi)接比較。

b. 對分辨率（Resolution）的影響

分辨(bian)率是指將大小(xiao)相近的DNA片段分離開的能力。這是瓊脂糖濃度最(zui)重要(yao)的影響。

• 低濃度凝膠（如0.5%-0.8%）：

篩孔大，允許(xu)大片段(duan)DNA（>10 kb）有效分離。小片段(duan)DNA跑得飛快，但彼此之(zhi)間難以分開，會擠在一起形成模糊的一條帶。

優點：適合分離大片段DNA。

缺點：凝膠非(fei)常(chang)脆弱柔軟，容易(yi)破(po)損。

• 中等濃度凝膠（如0.8%-2.0%）：

這是(shi)最(zui)常用的范(fan)(fan)圍(wei)(wei)，提供了一個良(liang)好的平衡，能有效分(fen)離0.5 kb - 10 kb范(fan)(fan)圍(wei)(wei)內(nei)的DNA片段，足以滿足大多(duo)數常規實(shi)驗（如質粒(li)、PCR產物(wu)、酶切產物(wu)的鑒定(ding)）。

1%與1.7%瓊脂(zhi)糖凝膠外觀對(dui)比

1%與1.7%瓊脂(zhi)糖凝膠分辨率對比

M1: 100bp Ladder;?M2: DS2000;?M3: DS5000;?M4: 1kb Ladder

 

• 高濃度凝膠（如2%-3%）：

篩(shai)孔(kong)小(xiao)，能很好地(di)分(fen)離小(xiao)片段DNA（<1 kb），甚至能分(fen)辨出(chu)幾(ji)十(shi)個(ge)堿(jian)基對的差異。大(da)片段DNA則幾(ji)乎無法移動，停(ting)留在加樣孔(kong)附(fu)近。

優(you)點(dian)：對小(xiao)片段DNA分辨率(lv)極高(gao)。

缺點：凝膠脆性大(da)，易碎。

?? 濃度錯誤直接導(dao)致分辨率下降(jiang)，大片(pian)段(duan)跑不動(dong)，小片(pian)段(duan)跑成一團。

 

???常見誤區二：電壓越高越好

瓊脂糖凝膠電(dian)(dian)泳里(li)電(dian)(dian)壓是個很關鍵的(de)因素(su)，直接影(ying)響到(dao)DNA/RNA 遷移速度、條帶清晰度和分離(li)效果。

1. 電壓與遷移速度

• 高電壓 → 分子遷移更快：電場力更強，帶負電的(de)核(he)酸(suan)分子(zi)快速向正極移動。

• 低電壓 → 遷移較慢：分(fen)離過(guo)程更(geng)溫和，條(tiao)帶移動較(jiao)慢。

2. 電壓與分辨率

• 低電壓（常用 4–6 V/cm）：遷(qian)移慢，但小片段(duan)(duan)與大片段(duan)(duan)的分(fen)離效果更好，分(fen)辨率高，適合區分(fen)相鄰(lin)大小的條帶。

• 高電壓（>10 V/cm）：條帶跑得(de)快，但容易拉寬、拖(tuo)尾，分辨(bian)率(lv)下降。

4V/cm、7V/cm、9V/cm電壓分辨率對比

M1: 100bp Ladder;?M2: DS2000

3. 電壓與熱效應

• 高電壓 → 產生焦耳熱：緩沖液升溫，凝(ning)膠變軟甚至熔化，導致條帶彎曲（smiling bands，笑臉效應）。

• 散熱不足：DNA 遷移速率不均勻(yun)，上下條帶彎曲，DNA降解，影響結果準確性。

• 解決辦法：降低(di)電壓，或者在(zai)低(di)溫條件下電泳（冰盒、電泳槽加(jia)冰袋(dai)）。

9V/cm電壓下(xia)不同電泳時間對比

M3: DS5000;?M4: 1kb Ladder

4. 實驗常用電壓范圍

• 常規瓊脂糖凝膠（0.7–2%）：4–10 V/cm（電壓(ya)與電泳槽兩電極間距離有關）。

• 小片段 DNA 分離（幾十到幾百 bp）：可稍高電壓（8–10 V/cm）。

• 大片段 DNA（>10 kb）：應低電壓（3–5 V/cm），防止擴散和分(fen)辨(bian)率丟失。

電(dian)壓(ya)越高，電(dian)泳(yong)越快，但分辨率和凝膠完(wan)整性可(ke)能受影響；低電(dian)壓(ya)遷(qian)移慢，卻能獲得(de)更(geng)清(qing)晰、更(geng)可(ke)靠的分離效果。

?? 推(tui)薦(jian)?5–10 V/cm，電極間(jian)距 20 cm 時，電壓保持在 100–200 V 之間(jian)。

???常見誤區三：只靠上樣染料定位

上樣緩沖液是DNA電泳中不可或缺(que)的(de)組成部分(fen)，它通常(chang)含有兩種主(zhu)要(yao)成分(fen)：

1. 惰性染料（如溴酚藍、二甲苯青）：用于實時監控電泳進程。
2. 增稠劑（如甘油、蔗糖、Ficoll）：增加樣品密度，確保樣品沉入加樣孔底部。

染料在電泳中起到了“視覺參考(kao)線”或“前(qian)鋒”的(de)作用(yong)，其定位(wei)功能主(zhu)要體(ti)現在：

1. 指示電泳進程，統一上樣基準。
2. 預估DNA片段的遷移位置：
   • 不同的染料在不同濃度的瓊脂糖凝膠中，其遷移行為與特定大小的DNA片段相似。因此，它們可以用來粗略估計未知DNA條帶的大小。
   • 溴酚藍（Blue：在0.8%-1.0%的瓊脂糖凝膠中，其遷移速度大約與300-500 bp的DNA片段相當。
   • 二甲苯青（Blue：在0.8%-1.0%的瓊脂糖凝膠中，其遷移速度大約與4000-5000 bp的DNA片段相當。
   • 例如：?如果你看到溴酚藍條帶快跑出凝膠了，你就知道所有小于500 bp的DNA片段可能已經接近凝膠底部，即將跑出。

???不能憑染料位置判斷片段大小，這也是為什么 DNA Marker 在電泳中不(bu)可或缺(que)。

???常見誤區四：Marker 隨便用

在分子生物學(xue)實驗中，DNA Marker常(chang)被簡(jian)單視為泳道中的“對(dui)照(zhao)”或“標尺”，但它的作用遠不止于此。Marker的選擇直接決定了實驗數據的可解釋性、準確性和美觀度，是實驗設計中最容易被忽視卻至關重要的一環。一個不合適的Marker可能導致整個實驗結果失去價值。

低質量或不匹配Marker帶來的三大問題：

1. 片段分布稀疏：導致大小判斷“失準”
   • 問題：?當Marker的條帶間隔過大，或恰好在你目標片段的關鍵區域缺少條帶時，你無法進行精確的插值估算。例如，如果你的PCR產物在750 bp左右，而Marker僅在500 bp和1000 bp有條帶，你只能模糊地估計產物大小在“500到1000 bp之間”，無法得出準確結論。
   • 后果：?實驗數據的精確度大打折扣，無法滿足克隆鑒定、酶切驗證等對大小要求嚴格的實驗需求。
2. 條帶模糊拖尾：影響結果呈現與可信度
   • 問題：?由于保存不當、反復凍融或生產工藝問題，Marker條帶可能出現擴散、模糊或強度不均（有的亮有的暗）。這不僅影響觀察，更嚴重影響成像質量。
   • 后果：?在論文、報告或展示中，模糊的Marker會讓整個實驗結果顯得不專業、不可靠，降低數據的可信度。審稿人或同行可能會因此質疑你的實驗嚴謹性。
3. 缺少關鍵指示條帶：降低實驗效率
   • 問題：?許多高效能的Marker會在500 bp、1000 bp、1500 bp和2000 bp等關鍵位置設置特別亮、特別粗的“指示條帶”或“參考條帶”。
   • 后果：?缺少這些指示條帶，你在快速瀏覽凝膠時就無法瞬間定位。你需要花費額外的時間去數條帶、比對大小，大大降低了實驗分析的效率。尤其在處理多個樣品時，這種效率損失尤為明顯。

如何選擇一個“合理”的Marker？

一個(ge)(ge)優秀的Marker不應(ying)只是(shi)DNA片段的簡(jian)單集(ji)合，而(er)應(ying)是(shi)一個(ge)(ge)精心(xin)設計的測量工(gong)具。以下是(shi)選擇標準：

???1. 覆蓋合適的片段范圍
這是最基本的要求。選擇的Marker其條帶范圍必須將你的目標DNA片段“包圍”在中間，而(er)不是(shi)落在(zai)兩端(duan)。例如：

• 常規PCR產物鑒定（100 bp - 2 kb）：?選擇范圍覆蓋100 bp至2000 bp的Ladder，如著名的100 bp Plus Ladder或1 kb Plus Ladder。
• 大片段酶切或基因組DNA分析（>5 kb）：?應選擇λ DNA HindIII digest等大片段Marker。
• 小片段 miRNA/siRNA 分析（<100 bp）：?需要專門的低分子量Marker。

???2. 條帶清晰、濃度均一

• 清晰銳利：?每條帶都應邊界清晰，無拖尾或擴散現象，這表明生產工藝好且保存得當。
• 亮度均一：?理想狀態下，所有條帶應具有相近的亮度（即DNA含量一致），這確保了不同大小的條帶都能被清晰成像，不會出現小條帶看不見、大條帶又過曝的情況。

???3. 含有突出的指示條帶，便于快速定位

• 這是區分“優秀”Marker和“普通”Marker的關鍵。許多高端Marker會特意將500 bp和1000 bp（有時還包括1500 bp和2000 bp）的條帶做得更濃、更亮。
• 好處：?在紫外燈下，你的眼睛能立刻抓住這幾個“地標”，瞬間建立起凝膠的空間距離與分子大小的對應關系，無需仔細數格子，極大提升了判讀效率。

???常見誤區五：忽略緩沖液與染料差異

在瓊(qiong)脂糖(tang)凝(ning)膠電(dian)泳中，新(xin)手往往將全部(bu)注意力集中在瓊(qiong)脂糖(tang)濃度和電(dian)壓(ya)設置(zhi)上，而忽略了兩個同樣至關(guan)重要的因素(su)：電泳緩沖體系和核酸染料。它們并非“通用”的(de)(de)試劑，其(qi)選(xuan)擇直接影(ying)響DNA的(de)(de)遷(qian)移率(lv)、條(tiao)帶分(fen)辨率(lv)和實驗安全性，錯誤(wu)的(de)(de)選(xuan)擇會悄然(ran)破(po)壞(huai)你(ni)的(de)(de)實驗結果(guo)。

一、電泳緩沖液：不僅僅是導電的溶液

最常用的緩沖液是TAE和(he)TBE，它們化學成分(fen)不同，決定了(le)其特性和(he)適用場(chang)景截然不同。

?? 如何選擇？

• 首選TAE的情況：?進行大片段DNA分離（如基因組DNA酶切）、DNA膠回收（兼容性更好）或需要快速電泳時。
• 首選TBE的情況：?進行小片段DNA分離（如PCR產物、SSR分析）、高分辨率電泳（如區分相差幾十bp的條帶）或需要長時間電泳時。

?? 重要提示：絕對不可將TAE和TBE緩沖液或其濃縮母液混用！?這會導致pH和(he)離子強(qiang)度異常，產生不可預測的(de)遷移結果。

二、核酸染料：安全與效能的權衡

染料(liao)的選擇關乎(hu)實驗結果的清晰度和(he)操作者的生命(ming)安(an)全。

?? 如何選擇？

• 追求成本與靈敏度：?可能仍在用EB染料，但必須配備嚴格的防護和廢物處理流程。

• 追求安全與便捷（現代實驗室首選）：AIE-Gelgreen或GelRed是更安全的選擇，尤其適合教學實驗室或沒有專門EB處理設施的實驗室。它們通常與藍光成像系統配套，能最大程度減少對DNA的損傷（UV會使DNA產生嘧啶二聚體，影響下游實驗）。
• 注意：?如果實驗下游需要進行膠回收克隆，建議選擇對酶活影響更小的染料。

總結與實驗設計指南

忽略緩沖(chong)液和染料(liao)的選(xuan)擇，就像用錯(cuo)誤的尺子和昏暗的燈光去(qu)測量(liang)一個精細的零件。

?? 在設計實驗時，請遵循這個流程進行選擇：

• 看片段大小：
  • 大片段(>5 kb)?→ 優先選TAE緩沖液。
  • 小片段(<1 kb)?→ 優先選TBE緩沖液，以獲得更高分辨率。
• 看實驗目的：
  • 常規鑒定?→ 可選擇性價比高的方案（如DSView染料、EB染料）。
  • 膠回收?→ 優先選TAE?+?對酶活無抑制的染料（如AIE-Gelgreen）。
  • 發表級高清圖片?→ 優先選高分辨率緩沖液(TBE)?+?高靈敏度/低背景的染料（如AIE-Gelgreen）。

AIE-Gelgreen核酸凝膠染料

• 看安全性與成本：
  • 安全絕對優先?→ 毫不猶豫地選擇AIE-Gelgreen等安全染料和藍光成像系統，即使成本稍高。
  • 權衡遷移準確性 → 如果擔心某些染料影響遷移，可在Marker和樣品中使用完全相同的上樣緩沖液和染料負載，以消除誤差。

因此，將緩沖液和染料視為與凝膠濃度、電壓同等重要的核心實驗參數，根據你的(de)具體需(xu)求進行理性(xing)選擇(ze)，是獲得(de)可靠、美觀、安全實驗結(jie)果的(de)必備步(bu)驟。

 

??小結

DNA 電泳看似“基(ji)礎”，卻暗藏(zang)不少原理性細節。掌(zhang)握濃度、電壓、緩沖液(ye)、Marker 與染料(liao)的選擇規律，才能保(bao)證結(jie)果：

• 條帶清晰

• 分辨率高

• 實驗可重復、可展示

 

?東盛相(xiang)關產品?

?? 東盛生物提供?高質量 DNA Marker、核酸染料、電泳緩沖液、上樣緩沖液、瓊脂糖等試劑，助力科研人(ren)員高(gao)效(xiao)、穩定地完成核酸(suan)電泳工作。

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