PCR教學試劑盒
Cat. #：P8021，P8022
產品簡介
本試劑(ji)盒是(shi)按(an)照教學實驗內容設(she)計(ji)的，符合(he)標(biao)準擴增流程的，教學用PCR反應試劑(ji)盒。本試劑(ji)盒所(suo)提供的模板為插入特(te)(te)定(ding)(ding)大(da)小(xiao)DNA片段的PBluescipt SK（+）重組(zu)質粒；引(yin)(yin)物(wu)為根據所(suo)插入DNA序列和擴增片段大(da)小(xiao)不同設(she)計(ji)的上下(xia)游引(yin)(yin)物(wu)。PCR結果可獲(huo)得特(te)(te)定(ding)(ding)大(da)小(xiao)（500 bp或1,000 bp）的PCR產(chan)物(wu)。
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產品組成
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Component |
P8021 （500 bp，30次） |
P8022 （1,000 bp，30次） |
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DNA模板 |
150 μl，500 bp |
150 μl，1,000 bp |
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上(shang)游引物?(10 μM) |
75 μl |
75 μl |
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下游引物(10 μM) |
75 μl |
75 μl |
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dNTP混合物(2.5 mM) |
150 μl |
150 μl |
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Taq DNA聚(ju)合酶(2.5 U/μl) |
40 μl |
40 μl |
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10×PCR緩沖液 |
500 μl |
500 μl |
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超純水 |
1 ml |
1 ml |
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說明書 |
1份 |
1份 |
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活性定義
一個(ge)活(huo)性單位（U）指用活(huo)性化的大馬哈魚(yu)精子DNA作為模(mo)板/引物，在72℃、30 min內，攝入10 nmol全核苷酸所需的酶量。
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保存條件
10×PCR緩(huan)沖液保存于4℃，其他(ta)成分-20℃保存。
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質量控制
純度檢測：經質量(liang)檢測，產品不含脫氧核(he)(he)糖核(he)(he)酸(suan)(suan)內(nei)切酶、脫氧核(he)(he)糖核(he)(he)酸(suan)(suan)外切酶和核(he)(he)糖核(he)(he)酸(suan)(suan)酶污染。
功能(neng)檢(jian)測：PCR方法檢(jian)測本(ben)試劑盒無(wu)(wu)宿主殘余DNA，也無(wu)(wu)其他(ta)DNA污(wu)染，能(neng)有效(xiao)完成PCR擴(kuo)增。
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應用舉例
1.?配制反應體系
請于冰上配置反應體系，體系大小與組分用量與添加順序可調整：
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Ordinal |
Component |
Volume (25 μl reaction volume) |
Volume (50 μl reaction volume) |
Volume (50 μl reaction volume，n管) |
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1 |
10×PCR緩沖液（Mg2+?Plus） |
2.5 μl |
5 μl |
5×(n+1) μl |
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2 |
dNTPs（2.5mM） |
2 μl |
4 μl |
4×(n+1) μl |
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3 |
上游(you)引物?? (10 μM) |
1 μl |
2 μl |
2×(n+1) μl或a μl×(n+1) |
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4 |
下游(you)引(yin)物?? (10 μM) |
1 μl |
2 μl |
2×(n+1) μl或(huo)a μl×(n+1) |
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5 |
Taq ? DNA聚合酶（2.5U/μl） |
0.5 μl |
1 μl |
1×(n+1) μl或a μl×(n+1) |
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6 |
template ? DNA |
2 μl |
4 μl |
4×(n+1) μl或a μl×(n+1) |
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7 |
超純水 |
16 μl |
32 μl |
32×(n+1) μl |
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8 |
石蠟油 |
如不能設置頂(ding)蓋溫度，需適量加入石蠟油。 |
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●?加(jia)入各(ge)組分后，請(qing)用槍頭反復吸(xi)吹幾次，充(chong)分混勻(yun)。
●?在(zai)一次配(pei)制多管需(xu)分(fen)裝(zhuang)時建議按（n+1）的反應(ying)液量配(pei)制，以確保(bao)分(fen)配(pei)時的耗損不會影響實(shi)驗，同時選擇(ze)大于總(zong)體積的離(li)心管便于混(hun)勻。
●?如需使用其(qi)他體積的PCR反應體系，請按各組分比例縮減或增加(jia)各組分用量。
●?組分中(zhong)引物、DNA模(mo)板、Taq DNA聚合酶常用于(yu)梯度(du)實驗，如有調整，請注意調超純(chun)水的用量至相應的體系。
●?將混勻的各(ge)管(guan)短暫離心(xin)，置于PCR儀(yi)中。
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2.?設定反應程序進行PCR反應
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Stage ? |
Temperature |
Time |
Number ? of Cycles |
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Initial ? Denaturation |
94℃ |
3 ? min |
1 |
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Denaturation |
94℃ |
30 ? sec |
30 |
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Annealing |
55℃ |
30 ? sec |
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Extension |
72℃ |
30 ? sec or 45 sec |
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Final ? Extension |
72℃ |
5 ? min |
1 |
●?設定PCR程(cheng)序時，請根據(ju)目(mu)的(de)(de)片段大小決定延伸(shen)時間，如(ru)果(guo)目(mu)的(de)(de)片段大小為(wei)500 bp時，延伸(shen)時間為(wei)30 sec，目(mu)的(de)(de)片段為(wei)1 kb時，延伸(shen)時間為(wei)45 sec。
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3.?分析結果
反應(ying)結束后取2-5?μl反應(ying)產物與loading buffer混勻(yun)后進行瓊脂糖凝膠電泳，通(tong)過凝膠成像設備觀察目的(de)條帶的(de)擴增(zeng)情況。
●?500 bp產物建議(yi)電(dian)泳條件(jian)為1.7%瓊(qiong)脂糖凝(ning)膠，0.5×TBE，7 V/cm，20-40 min，建議(yi)Marker為?DSTM 2000（M1101）。
●?1 kb產物建(jian)(jian)議電泳條件為(wei)(wei)1.0%瓊脂(zhi)糖凝膠，1×TAE，7 V/cm，20-40 min，建(jian)(jian)議Marker為(wei)(wei)?DSTM 5000（M1111）。
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注意事項
請(qing)嚴格按(an)照(zhao)說明書提供的實(shi)(shi)驗(yan)體系及實(shi)(shi)驗(yan)條件進行試(shi)驗(yan)。
室(shi)溫下Taq DNA聚合酶(mei)有(you)一定的活性(xing)，為(wei)避免發生非特異性(xing)擴增，請于冰上(shang)配置反應體系，并(bing)且最后添加(jia)Taq DNA聚合酶(mei)或模板DNA。
挑取菌落時，應選擇單菌落，不要挑取太多菌體，以免影響PCR結果。