TRAzol

產品說明

TRAzol可(ke)以從(cong)動(dong)物組(zu)織、植物材料、各種微生物以及培養細胞等組(zu)織材料中提(ti)取總(zong)RNA。樣品在(zai)TRAzol中能夠充分(fen)(fen)(fen)被(bei)裂解，在(zai)加入(ru)氯仿離心后(hou)，溶液會形成上(shang)清(qing)(qing)(qing)層、中間(jian)層和有機層（下層），RNA分(fen)(fen)(fen)布在(zai)上(shang)清(qing)(qing)(qing)層中，收集(ji)上(shang)清(qing)(qing)(qing)層后(hou)，經異丙醇沉(chen)淀便可(ke)以回(hui)收得到總(zong)RNA。經本(ben)制品提(ti)取的總(zong)RNA純(chun)(chun)度(du)高，基本(ben)不含(han)蛋白(bai)質及基因(yin)組(zu)DNA，提(ti)取的RNA可(ke)以直接(jie)用于Northern雜(za)交、斑點雜(za)交、mRNA純(chun)(chun)化、體外翻譯、RNA分(fen)(fen)(fen)解酶(mei)的保護(hu)分(fen)(fen)(fen)析、RT-PCR、構建cDNA文庫等各種分(fen)(fen)(fen)子生物學實驗。

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產品組分

需要自備氯仿、異丙醇、RNase-free 75%乙醇、DEPC處(chu)理水（R2041/R2042）

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保存條件

室溫運(yun)輸，2-8℃避光保存。

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注意事項

● ??TRAzol具(ju)有腐蝕性(xing)，操作過程中應(ying)做好(hao)防護，避免直(zhi)接接觸皮膚或吸入口鼻。沾染(ran)后(hou)應(ying)立即用大量清水沖洗(xi)，必要時請就醫處理。

● ??嚴(yan)防(fang)操(cao)作(zuo)環境(jing)、使用的容器、耗材和試劑(ji)的RNase污染。操(cao)作(zuo)過程(cheng)中勤換手套(tao)。

● ??根據起始材料(liao)(liao)量(liang)的(de)(de)(de)不同使(shi)用不同體積的(de)(de)(de)溶液（見下表）。過多或(huo)過少的(de)(de)(de)使(shi)用量(liang)都可(ke)能(neng)影(ying)響RNA的(de)(de)(de)質量(liang)或(huo)產量(liang)。若起始材料(liao)(liao)量(liang)很(hen)少，RNA預計(ji)產量(liang)很(hen)低，在異丙醇沉(chen)淀(dian)時，可(ke)加(jia)入20 mg/ml肝(gan)糖原(yuan)溶液0.5-1 μl促(cu)進(jin)RNA沉(chen)淀(dian)。

● ??不(bu)同起始材料試(shi)劑用量及TRAzol用量。

● ??使用本產品提取的(de)RNA一般不含有DNA污(wu)染。在極少數情況下（與組織pH值等(deng)相關），如(ru)果有DNA污(wu)染而又必須去除，則可以用RNase-free的(de)DNase處理樣(yang)品。

● ??防止DNA污染方法：a.?減少樣(yang)本起始用量，如將100 mg的植(zhi)物組織(zhi)減少為50 mg，將30 mg的動物組織(zhi)減少為10 mg；

????????????????????? b.?在(zai)加入TRAzol之后加入5-10 ul 3M NaAc(pH5.2)。

● ??請嚴格遵照操(cao)作(zuo)步(bu)驟操(cao)作(zuo)。

●? ?有(you)關RNA的吸光(guang)度(du)說明如(ru)下：

260 nm、320 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白質等有機物的吸光度值。OD₂₆₀/OD₂₈₀（R）體現(xian)了RNA中的(de)(de)蛋白質(zhi)等(deng)(deng)有機物(wu)的(de)(de)污(wu)染(ran)程度(du)，質(zhi)量較(jiao)好的(de)(de)RNA的(de)(de)R值應(ying)在1.8-2.0之間(jian)，當R<1.8時，溶液(ye)中的(de)(de)蛋白質(zhi)等(deng)(deng)有機物(wu)的(de)(de)污(wu)染(ran)比較(jiao)明顯；當R>2.2時，說明RNA已經被水(shui)解成了單(dan)核(he)苷酸。在對核(he)酸進行吸光度(du)檢測時，需要(yao)注意稀(xi)釋液(ye)應(ying)使用TE Buffer。

●? ?RNA濃度=（OD₂₆₀-OD₃₂₀）×稀釋倍數×0.04 μg/μl

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操作步驟

1.??????實驗樣品的研磨和勻漿

A.?貼壁培養細胞

倒出培養液，用1X PBS清洗一次，每10 cm²生長的培(pei)養細(xi)胞中加入(ru)1ml的TRAzol，水平(ping)放置片刻(ke)，使裂(lie)(lie)(lie)解(jie)液均勻(yun)分布于細(xi)胞表面并裂(lie)(lie)(lie)解(jie)細(xi)胞，然后使用(yong)移(yi)液槍吹打細(xi)胞使其(qi)脫落(luo)（對于貼壁(bi)牢固的培(pei)養細(xi)胞可用(yong)細(xi)胞刮勺剝(bo)離細(xi)胞）。將內含(han)細(xi)胞的裂(lie)(lie)(lie)解(jie)液轉(zhuan)移(yi)至離心管中，用(yong)移(yi)液槍反復吹吸直至裂(lie)(lie)(lie)解(jie)液中無明顯沉淀。室(shi)溫(wen)靜置5 min。

B.?懸浮培養細胞

將懸浮培養細胞連同培養液一起倒入離心管中，8,000 rpm，4℃離心2 min，棄上清，向每10⁷個細胞中加入l-2 ml的TRAzol。用(yong)移液槍(qiang)反復吹吸(xi)直(zhi)至裂解液中無(wu)明顯沉淀，室溫(wen)靜置5 min。

C.?動物組織、植物材(cai)料(liao)樣品(pin)

將(jiang)(jiang)超低溫(wen)凍結的(de)(de)RNA提取樣(yang)品稱(cheng)量(liang)后(hou)迅速轉移(yi)(yi)至用(yong)液(ye)(ye)氮預冷的(de)(de)研(yan)(yan)缽中(zhong)(zhong)，用(yong)研(yan)(yan)杵研(yan)(yan)磨(mo)組織，其間不斷加入液(ye)(ye)氮，直(zhi)至研(yan)(yan)磨(mo)成粉末狀(zhuang)（無明顯的(de)(de)可(ke)見(jian)顆(ke)粒，如果沒(mei)有研(yan)(yan)磨(mo)徹底會(hui)影響RNA的(de)(de)收率和(he)質量(liang)）。對于普通(tong)的(de)(de)RNA提取樣(yang)品，可(ke)以向研(yan)(yan)缽中(zhong)(zhong)加入適(shi)量(liang)的(de)(de)TRAzol，將(jiang)(jiang)研(yan)(yan)磨(mo)成粉末狀(zhuang)的(de)(de)樣(yang)品完全覆蓋，然后(hou)室溫(wen)靜置，直(zhi)至樣(yang)品完全融化，再用(yong)研(yan)(yan)杵繼續研(yan)(yan)磨(mo)至裂解液(ye)(ye)呈透明狀(zhuang)。對于特殊(shu)樣(yang)品，如肝、脾、骨及(ji)軟骨等，可(ke)以將(jiang)(jiang)研(yan)(yan)磨(mo)成粉末狀(zhuang)的(de)(de)樣(yang)品加入到含有適(shi)量(liang)的(de)(de)TRAzol的(de)(de)勻(yun)漿(jiang)管中(zhong)(zhong)，把勻(yun)漿(jiang)管置于冰浴中(zhong)(zhong)進(jin)行勻(yun)漿(jiang)，直(zhi)至勻(yun)漿(jiang)液(ye)(ye)呈無顆(ke)粒透明狀(zhuang)。將(jiang)(jiang)勻(yun)漿(jiang)液(ye)(ye)轉移(yi)(yi)至離心(xin)管中(zhong)(zhong)，室溫(wen)靜置5 min。12,000 rpm 4 ℃離心(xin)5 min，小心(xin)吸取上清(qing)液(ye)(ye)，移(yi)(yi)入新(xin)的(de)(de)離心(xin)管中(zhong)(zhong)（切(qie)勿吸取沉淀(dian)）。

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2.??????Total RNA的提取

1??向(xiang)上述步驟中的勻漿裂解液中加(jia)入氯(lv)仿（TRAzol的1/5體積量），蓋(gai)(gai)緊(jin)離心(xin)(xin)管(guan)蓋(gai)(gai)，用力振(zhen)蕩（氯(lv)仿沸點低、易揮發，振(zhen)蕩時(shi)應小心(xin)(xin)離心(xin)(xin)管(guan)蓋(gai)(gai)突然彈開）。待充分乳化(hua)溶液呈乳白狀（無分相現象）后，再室(shi)溫靜置(zhi)2 min。

2? 12,000 rpm 4 ℃離心10 min。

3??從(cong)離心機中(zhong)(zhong)小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，即：無色(se)(se)的(de)(de)上清液、中(zhong)(zhong)間的(de)(de)白(bai)色(se)(se)層及(ji)帶有顏色(se)(se)的(de)(de)下層有機相，吸(xi)取上清液轉(zhuan)移至另(ling)一新的(de)(de)離心管中(zhong)(zhong)（切忌吸(xi)出白(bai)色(se)(se)中(zhong)(zhong)間層）。

（如樣(yang)品含有較多多糖(tang)多酚，請增加以下(xia)步驟：在上清(qing)液(ye)中加入0.2X上清(qing)液(ye)體(ti)積(ji)的5 M NaCl及1X上清(qing)液(ye)體(ti)積(ji)的酚/氯仿（1:1），混勻，12000 rpm離(li)心5-10 min?，取上清(qing)液(ye)加入等體(ti)積(ji)氯仿，混勻，12000 rpm?離(li)心?5-10 min，至(zhi)第4步。）

4??向(xiang)上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒(dao)離心管(guan)充(chong)分混勻后，在15-30℃下靜置10 min。

5? 12,000 rpm 4℃離心(xin)10 min。一(yi)般在離心(xin)后，試管底部會(hui)出現沉(chen)淀(dian)。

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3.??????RNA沉淀的清洗

小(xiao)(xiao)心(xin)棄(qi)去(qu)上清，緩慢(man)地沿離心(xin)管(guan)(guan)壁(bi)(bi)加(jia)入75％的乙(yi)醇(chun)1 ml（切勿觸及(ji)沉淀），輕輕上下顛倒洗(xi)滌(di)離心(xin)管(guan)(guan)管(guan)(guan)壁(bi)(bi)，12,000 rpm，4 ℃離心(xin)2 min后小(xiao)(xiao)心(xin)棄(qi)去(qu)乙(yi)醇(chun)（為了(le)更好地控制RNA中的鹽離子(zi)含量(liang)，應盡量(liang)除凈乙(yi)醇(chun)），重(zhong)復洗(xi)滌(di)一次(ci)。

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4.??????RNA的溶解

室溫干燥沉(chen)淀2-5 min（不可以(yi)離心或加熱(re)干燥，否(fou)則(ze)RNA將會(hui)很難溶(rong)解(jie)），加入適量的RNase-free水(shui)溶(rong)解(jie)沉(chen)淀，必要時可用移液槍輕輕吹(chui)打沉(chen)淀，待RNA沉(chen)淀完全溶(rong)解(jie)后(hou)于-80℃保(bao)存。