RT-PCR Kit（逆轉錄試劑盒）

產品說明

RT-PCR Kit(逆(ni)轉錄試劑盒）是專為兩步(bu)法RT-PCR第一(yi)步(bu)實(shi)(shi)驗(yan)配制的(de)(de)、具(ju)有高靈敏度的(de)(de)RT-PCR反(fan)應系統。該系統合理配備了(le)(le)與(yu)cDNA第一(yi)鏈(lian)合成反(fan)應相關的(de)(de)各(ge)種組分，優(you)化的(de)(de)體系保證了(le)(le)M-MLV具(ju)有高效的(de)(de)逆(ni)轉錄酶活性，所得(de)cDNA對后續的(de)(de)PCR或定量(liang)PCR實(shi)(shi)驗(yan)兼容性好(hao)，可(ke)用于檢測(ce)稀(xi)有基(ji)因的(de)(de)表(biao)達、從(cong)極少數(shu)細(xi)胞中定量(liang)檢測(ce)特定mRNA的(de)(de)表(biao)達水平、克隆特定基(ji)因的(de)(de)cDNA片(pian)段等。

M-MLV逆(ni)轉錄(lu)酶(mei)是由一個71 kD的(de)單亞基組(zu)成的(de)重(zhong)組(zu)型DNA逆(ni)轉錄(lu)聚合(he)酶(mei)。可以催(cui)化以RNA或DNA：RNA雜交鏈(lian)為(wei)模板的(de)互補DNA?的(de)聚合(he)反應。本酶(mei)經修飾RNase H活(huo)性比普通的(de)逆(ni)轉錄(lu)酶(mei)要弱(ruo)很多，因此在合(he)成第一鏈(lian)cDNA的(de)過(guo)程中，可保證RNA的(de)降解程度較低，從而使得率提高。

產品組分

R1011可進行(xing)(xing)20次(ci)逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)反應,R1012可進行(xing)(xing)100次(ci)逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)反應（20 μl?標(biao)準PCR反應體系(xi)，每次(ci)使用?M-MLV 1μl）。

M-MLV?儲存液

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)

200 mM NaCl

0.1 mM EDTA

1 mM DTT

0.01% NP-40

50% glycerol

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5xfirst-strand buffer?成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)

375 mM KCl

15 mM MgCl2

50 mM DTT

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質量檢測

逆轉錄酶活性檢測

使用[32P]dCTP作(zuo)為標記，200 U的(de)?M-MLV以1μg、1.2 kb的(de)RNA為模板進逆轉錄反(fan)應，最低可得到(dao)120ng的(de)cDNA，所得cDNA長(chang)(chang)度?>?全長(chang)(chang)的(de)90%。

核酸外切酶活性檢測

混合50ng的(de)標記DNA?或RNA與200U M-MLV在1×反應緩沖(chong)液體系中，37℃溫浴1 h，檢(jian)測DNA和RNA降解(jie)都不到總量的(de)1%。

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適用范圍

第一鏈cDNA?合(he)成

cDNA文庫構建

RT-PCR

引物延伸

3'和5' RACE

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注意事項

l??成功的(de)(de)cDNA合成來自高(gao)質量的(de)(de)RNA。高(gao)質量的(de)(de)RNA至少應保證全長(chang)的(de)(de)完整性并(bing)且不含(han)逆(ni)轉錄(lu)酶的(de)(de)抑制(zhi)(zhi)劑(ji)，如EDTA或?SDS。用于cDNA合成反(fan)應的(de)(de)溶(rong)(rong)液(ye)試劑(ji)盡可能(neng)用DEPC進行處理，并(bing)在高(gao)壓滅菌后使用。有些(xie)試劑(ji)不能(neng)用高(gao)壓滅菌處理時，首先用經(jing)過(guo)滅菌的(de)(de)器具、水等(deng)配(pei)制(zhi)(zhi)溶(rong)(rong)液(ye)后，再將溶(rong)(rong)液(ye)進行過(guo)濾(lv)除菌處理。

l??為了增加(jia)貯存RNA樣品的(de)穩定性，可(ke)(ke)以(yi)將(jiang)RNA溶解(jie)在去離子的(de)甲(jia)酰(xian)(xian)胺中(zhong)，存于(yu)-70℃。用于(yu)保存?RNA?的(de)甲(jia)酰(xian)(xian)胺一(yi)(yi)定不能含(han)有降解(jie)RNA的(de)雜物。來源于(yu)胰臟(zang)的(de)RNA至少(shao)可(ke)(ke)以(yi)在甲(jia)酰(xian)(xian)胺中(zhong)保存一(yi)(yi)年。當準(zhun)備使(shi)用RNA時，可(ke)(ke)以(yi)使(shi)用下列(lie)方法沉淀RNA：加(jia)入NaCl至0.2 M同時加(jia)入4倍體積的(de)乙醇，室溫放置3-5 min，10,000 rpm離心5 min。

l??在(zai)逆轉錄(lu)反應(ying)中經(jing)常加入(ru)RNase抑制劑（RNasin）以增加cDNA合(he)成(cheng)的(de)(de)長度和產量。在(zai)第(di)一鏈合(he)成(cheng)反應(ying)中，RNase抑制劑在(zai)緩沖液和還原劑（如?DTT）存在(zai)的(de)(de)條件下加入(ru)，因為(wei)cDNA合(he)成(cheng)前的(de)(de)過程會使(shi)抑制劑變(bian)性(xing)，從而釋放出RNase。但是RNase抑制劑僅防(fang)止(zhi)RNase A，B，C?對RNA的(de)(de)降解，并(bing)不能防(fang)止(zhi)皮膚上的(de)(de)RNase，因此盡管使(shi)用了(le)RNase抑制劑，也要小心不要從手指(zhi)上引入(ru)RNase。

l??較高的保溫溫度有助(zhu)于(yu)RNA二級結(jie)構(gou)的打開，增加反應的產量(liang)。

l??使用(yong)簡單的(de)RNA純化方法即可獲得滿(man)足(zu)RT-PCR反應的(de)RNA，但為(wei)了保(bao)證實驗的(de)成功率，建議使用(yong)GTC法（異(yi)硫(liu)氰酸胍法）制備的(de)高純度RNA。

l??為防止RNA降解，應盡量避免反復凍(dong)融(rong)，最好保存于-70℃。

l??最佳的PCR反應條件(jian)，因PCR擴增(zeng)儀的不同而(er)不同，所(suo)以在使(shi)用(yong)您(nin)的樣品之(zhi)前最好先試做一下(xia)control反應，以確定最佳的PCR反應條件(jian)。

l??cDNA產物應置于(yu)-20℃保存。

l??當以cDNA為模(mo)板進行(xing)PCR之前，使用RNase H處理cDNA，可以提高PCR反應的靈(ling)敏度。

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操作步驟

1?在冰浴的無菌離心管中配制下列混合物

1-5μg RNA

1μl Oligo(dT)₁₅?或(huo)Random primer，

補RNase-free ddH₂O至13.4μl；

2進行變性退火反應

70℃溫浴5 min,

簡短離心(xin)后冰浴5 min；

3在上述離心(xin)管中配制反轉錄反應(ying)液

4 μl? 5×first-strand buffer

1 μl? dNTPs（10 mM each）

0.6μl ?RNasin ,

1 μl? ?M-MLV；

4按下(xia)列條件進行反轉錄反應

Oligo (dT)₁₅?：42℃溫浴60 min；

Random primer：?37℃溫浴(yu)60 min。

5終止反應

70℃溫浴5 min終(zhong)止反應，置冰上進(jin)行后(hou)續實(shi)驗或-20℃保存。

6用RNase-free ddH₂O將(jiang)反應體系(xi)稀釋到50μl，取2-5μl進(jin)行PCR擴增反應。