M-MLV?逆轉錄酶

產品說明

M-MLV逆轉錄(lu)酶(mei)是由一個?71 kD的(de)單(dan)亞基組成(cheng)的(de)重組型(xing)DNA逆轉錄(lu)聚合(he)(he)酶(mei)。可以催化以RNA或DNA：RNA雜交鏈為模板的(de)互補DNA?的(de)聚合(he)(he)反應。本(ben)酶(mei)經(jing)修(xiu)飾RNase H活性比普通的(de)逆轉錄(lu)酶(mei)要(yao)弱很多，因此(ci)在合(he)(he)成(cheng)第一鏈cDNA的(de)過程中，可保證(zheng)RNA的(de)降解程度較低(di)，從而(er)使得(de)率提高。

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產品組分

R1041可(ke)進(jin)行25次(ci)逆轉錄(lu)反(fan)應，R1042可(ke)進(jin)行50次(ci)逆轉錄(lu)反(fan)應（20 μl?標(biao)準?PCR?反(fan)應體系，每次(ci)使用?M-MLV 1 μl）。

M-MLV?儲存液成分

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，200 mM NaCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，0.01% NP-40，50% glycerol

5x first-strand buffer?成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)，375 mM KCl，15 mM MgCl₂，50 mM DTT

保存條件

-20℃保存，避免(mian)反復凍融。

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質量檢測

逆轉錄酶活性檢測

使用[₃₂P]dCTP作為標記，200 U的(de)(de)(de)M-MLV以1μg、1.2 kb的(de)(de)(de)RNA為模(mo)板進行逆轉(zhuan)錄反應，最(zui)低可(ke)得到120 ng的(de)(de)(de)cDNA，所(suo)得cDNA長(chang)度?>?全長(chang)的(de)(de)(de)90%。

核酸外切酶活性檢測

混(hun)合50 ng的標記DNA或RNA與200 U M-MLV在(zai)1×反應(ying)緩沖液體系(xi)中，37℃溫浴1 h，檢測DNA和RNA降解都不(bu)到總量的1%。

核酸內切酶活性檢測

混合1μgⅠ型超螺旋(xuan)質粒DNA與500 U M-MLV在(zai)1×反(fan)應緩沖液體系中(zhong)，37℃溫浴(yu)1 h，瓊脂糖電(dian)泳(yong)檢測，無明顯的剪切。

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適用范圍

第(di)一鏈cDNA?合成；cDNA?文庫構建；RT-PCR；引物延(yan)伸；3'?和?5' RACE。

注意事項

l??成功(gong)的(de)(de)cDNA合成來自(zi)高質(zhi)量的(de)(de)RNA。高質(zhi)量的(de)(de)RNA至少應保證(zheng)全長的(de)(de)完整(zheng)性并且不含(han)逆(ni)轉錄(lu)酶的(de)(de)抑(yi)制劑，如EDTA或(huo)?SDS。用(yong)于cDNA合成反應的(de)(de)溶(rong)液(ye)試(shi)劑盡可能(neng)用(yong)DEPC進行處(chu)理(li)(li)，并在高壓滅菌后(hou)(hou)使用(yong)。有些試(shi)劑不能(neng)用(yong)高壓滅菌處(chu)理(li)(li)時，首先(xian)用(yong)經過滅菌的(de)(de)器具、水等配制溶(rong)液(ye)后(hou)(hou)，再(zai)將溶(rong)液(ye)進行過濾除菌處(chu)理(li)(li)。

l??為了增(zeng)加貯(zhu)存RNA樣品(pin)的穩定(ding)性，可(ke)以將RNA溶(rong)解在(zai)去離(li)(li)子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存?RNA?的甲酰胺一定(ding)不(bu)能(neng)含(han)有降(jiang)解RNA的雜(za)物。來(lai)源(yuan)于胰臟的RNA至(zhi)少可(ke)以在(zai)甲酰胺中保存一年。當準(zhun)備使用RNA時，可(ke)以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至(zhi)0.2 M同時加入4倍體積(ji)的乙醇，室溫放(fang)置(zhi)3-5 min，10,000 rpm離(li)(li)心5 min。

l??在逆(ni)轉(zhuan)錄反應中(zhong)(zhong)經常加入(ru)RNase抑(yi)(yi)制劑(ji)（RNasin）以(yi)增加cDNA合成的(de)長度和產量(liang)。在第一鏈合成反應中(zhong)(zhong)，RNase抑(yi)(yi)制劑(ji)在緩沖液和還原劑(ji)（如?DTT）存在的(de)條件(jian)下加入(ru)，因(yin)為cDNA合成前(qian)的(de)過程會使抑(yi)(yi)制劑(ji)變性(xing)，從而(er)釋(shi)放出RNase。但是(shi)RNase抑(yi)(yi)制劑(ji)僅防止(zhi)RNase A，B，C?對RNA的(de)降解，并(bing)不能防止(zhi)皮膚上的(de)RNase，因(yin)此盡管使用了RNase抑(yi)(yi)制劑(ji)，也要小心不要從手指上引入(ru)RNase。

l??較高(gao)的保溫(wen)溫(wen)度有助(zhu)于RNA二級結構的打開，增加反應的產量。

l??使用簡單的(de)RNA純(chun)化方法即(ji)可獲(huo)得滿(man)足(zu)RT-PCR反應的(de)RNA，但為了保證實驗的(de)成功率，建議(yi)使用GTC法（異硫(liu)氰酸胍(gua)法）制(zhi)備(bei)的(de)高純(chun)度RNA。

l??為防止RNA降解(jie)，應(ying)盡量避免反復凍融(rong)，最好保(bao)存于(yu)-70℃。

l??最佳的PCR反應(ying)條件(jian)，因PCR擴增儀(yi)的不同(tong)而(er)不同(tong)，所以在使用您(nin)的樣品(pin)之前最好先試(shi)做一下(xia)control反應(ying)，以確定最佳的PCR反應(ying)條件(jian)。

l??cDNA產物應置于-20℃保存。

l??當以(yi)cDNA為模板進行PCR之(zhi)前(qian)，使(shi)用RNase H處理cDNA，可以(yi)提(ti)高PCR反應的靈敏(min)度。

操作步驟

1?在冰浴的無菌離心管(guan)中配制下列混合物

2?進(jin)行變性(xing)退火(huo)反應

70℃溫浴5 min，簡(jian)短(duan)離心后冰浴5 min。

3?在上述離心管(guan)中(zhong)配制(zhi)反(fan)(fan)轉錄反(fan)(fan)應液

4?按(an)下列條件進行(xing)反(fan)轉錄反(fan)應

Oligo (dT)₁₅?：42℃溫浴60 min；

Random primer：?37℃溫浴60 min。

5?終止反應

70℃溫(wen)浴(yu)5 min終(zhong)止(zhi)反應，置冰上進行后續(xu)實驗或-20℃保存(cun)。

6?用RNase-free ddH₂O將反應體系(xi)稀釋到50μl，取2-5μl進行PCR擴增(zeng)反應。